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对虾中氯霉素残留的分析方法研究

阅读次数: 加入时间:2014-01-29

    一、引言
    氯霉素(chIoramphenicoI,简称CAP)是1947 年首次从微生物中分离出来的一种抗生素[1],目前用人工合成方法合成。氯霉素广泛用于动物各种传染性疾病的治疗[2],被认为是抑制对虾病原弧菌作用最强的药物[3]。由于氯霉素存在严重的副作用,能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病,尤其是氯霉素在动物组织中的残留不仅对动物和人体有直接危害,更严重的是低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性,对人类的健康构成巨大的潜在危胁。许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素。欧盟提出了一些有关虾氯霉素污染的新规定[4],进口虾中一旦被查出含有氯霉素,立即拒货,甚至销毁。我国也规定氯霉素在所有动物性产品中的检出量为零[5]。因此,建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。目前已相继建立起气相色谱[6]、液相色谱[7]、薄层色谱[5]、微生物[8]及酶联检测[9]等氯霉素残留分析方法,但这些方法在微量组分定量测定上均有一定的局限性。本工作建立了高效液相色谱-质谱-质谱联用技术(LC-MS-MS)测定对虾中氯霉素残留的方法。
    参考阅读:虾苗的腐鳃病如何防治?
    二、实验部分
    1、仪器与条件
    API3000液相色谱-质谱-质谱联用仪(美国生物应用系统公司)。液相色谱条件:C18 InertsiI 5 ODS-2 色谱柱(5μm,2.1mm X 50mm,MetaChem TechnoIegies Inc.);甲醇(液相色谱纯,Tedia Company Inc.,USA)为流动相,流速为300μL/min,进样量为20μL。质谱条件:电喷雾电离源(ESI),负离子模式采集。
    2、标准样品配制
    准确称取一定量氯霉素(纯度99. 0%,Labor Dr. Ehrenstorfers,Germany),用甲醇溶解后配成一定浓度的标准储备液,使用时逐级稀释成浓度为0.56-56.00 μg/L的标准溶液。
    3、样品处理
    将去皮、头和鳍的对虾组织绞碎,准确称取2g,放入离心试管中,加入2mL乙酸乙酯,搅拌均匀,超声提取20分钟,4000r/min 离心10min,分离出上清液。重复提取一次,将2次的上清液合并,于45℃水浴上蒸发至大约0.5mL。用4mL乙酸乙酯分两次将提取物转移至另一支试管中,同时弃去不溶物。
    再次将乙酸乙酯溶液蒸发至近干后,加入2mL甲醇溶解提取物,加入4%的NaCl溶液,摇匀;再加入正己烷,萃取,弃去正己烷层;向水层中加入乙酸乙酯,振荡,静置分层后,弃去水层;乙酸乙酯层经无水硫酸钠脱水后,浓缩至0.5mL,用于测定。向对虾组织中注射已知量的氯霉素,然后按上述方法提取,提取液用于回收率的测定。
    三、结果与讨论
    1、质谱条件的建立
    用液相色谱法进行定量分析,有时一个色谱峰可能包含几种不同的组分,尤其是生物样品,成分复杂,如果仅靠峰面积定量,会给定量分析造成误差。为了消除干扰,实验采用串联质谱的多反应监测(MRM)技术[10],这样得到的总离子色谱图进行了3次选择:液相色谱(LC)选择组分的保留时间,一级质谱(MS)选择分子量,二级质谱(MS/MS)选择子离子,因此可以认为这样得到的色谱峰没有任何干扰。然后根据峰面积进行定量分析。这是复杂体系中进行微量成分定量分析的有效方法。
    氯霉素的结构如图1所示。其分子量为322(35Cl),一级质谱检测得到的准分子离子峰是m/z 321,为[M-H]-。对m/z 321做MS/MS,优化质谱参数后,得到氯霉素碎片离子,结果示于图2,主要质谱峰对应的可能子离子列于表1。因m/z 152是基峰(信号最强),故我们选取m/z 321/152为监测离子对,用于氯霉素的定量测定。

图1 氯霉素的结构式

表1 氯霉素母离子及其相应的子离子

图2 氯霉素MS/MS质谱图

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